（1）準(zhǔn)備安瓿管用于液氮保藏的安瓿管，食用菌滅菌鍋爐要求能耐受溫度突然變化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸鹽玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的，或能容1．2mm液體的。

（2）加保護劑與滅菌保存細菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的細胞時，則將空安瓿管塞上棉塞，1．05kg/cm2，121．3℃滅菌15分鐘：若作保存霉菌菌絲體用則需在安瓿管內(nèi)預(yù)先加入保護劑如10％的甘油蒸餾水溶液或10％二甲亞砜蒸餾水溶液，加入量以能浸沒以后加入的菌落圓塊為限，而后再用1．05kg/cm2>，121．3℃滅菌15分鐘。

（3）接入菌種將菌種用10％的甘油蒸餾水溶液制成菌懸液，裝入已滅菌的安瓿管；霉菌菌絲體則可用滅菌打孔器，從平板內(nèi)切取菌落圓塊，放入含有保護劑的安瓿管內(nèi)，然后用火焰熔封。浸入水中檢查有無漏洞。

（4）凍結(jié)再將已封口的安瓿管以每分鐘下降1℃的慢速凍結(jié)至-30℃。若細胞急劇冷凍，則在細胞內(nèi)會形成冰的結(jié)晶，因而降低存活率。

（5）保藏經(jīng)凍結(jié)至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷凍保藏器（圖Ⅶ-14）的小圓筒內(nèi)，然后再將小圓筒放入液氮保藏器內(nèi)。液氮保藏器內(nèi)的氣相為-150℃，液態(tài)氮內(nèi)為-196℃。

（6）恢復(fù)培養(yǎng)保藏的菌種需要用時，將安瓿管取出，立即放入38—40℃的水浴中進行急劇解凍，直到全部融化為止。再打開安瓿管，將內(nèi)容物移入適宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

此法除適宜于一般微生物的保藏外，對一些用冷凍干燥法都難以保存的微生物如支原體、衣原體、氫細菌、難以形成孢子的霉菌、噬菌體及動物細胞均可長期保藏，而且性狀不變異。缺點是需要特殊設(shè)備。

冷凍干燥保藏法

（1）準(zhǔn)備安瓿管用于冷凍干燥菌種保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形狀可用長頸球形底的，亦稱淚滴型安瓿管（圖Ⅶ-15），大小要求外徑6—7．5mm，長105mm，球部直徑9—11mm，壁厚0．6—1．2mm。也可用沒有球部的管狀安瓿管。塞好棉塞，1．05kg/cm2>，121．3℃滅菌30分鐘，備用。

（2）準(zhǔn)備菌種，用冷凍干燥法保藏的菌種，其保藏期可達數(shù)年至十?dāng)?shù)年，為了在許多年后不出差錯，故所用菌種要特別注意其純度，即不能有雜菌污染，然后在最適培養(yǎng)基中用最適溫度培養(yǎng)，使培養(yǎng)出良好的培養(yǎng)物。細菌和酵母的菌齡要求超過對數(shù)生長期，若用對數(shù)生長期的菌種進行保藏，其存活率反而降低。一般，細菌要求24—48小時的培養(yǎng)物；酵母需培養(yǎng)3天；形成孢子的微生物則宜保存孢子；放線菌與絲狀真菌則培養(yǎng)7—10天。

（3）制備菌懸液與分裝以細菌斜面為例，用脫脂牛乳2ml左右加入斜面試管中，制成濃菌液，每支安瓿管分裝0．2ml。

（4）冷凍冷凍干燥器有成套的裝置出售，價值昂貴，此處介紹的是簡易方法與裝置，可達到同樣的目的。

將分裝好的安瓿管放低溫冰箱中冷凍，無低溫冰箱可用冷凍劑如干冰（固體CO2>）酒精液或干冰丙酮液，溫度可達-70℃。將安瓿管插入冷凍劑，只需冷凍4—5分鐘，即可使懸液結(jié)冰。

（5）真空干燥為在真空干燥時使樣品保持凍結(jié)狀態(tài)，需準(zhǔn)備冷凍槽，槽內(nèi)放碎冰塊與食鹽，混合均勻，可冷至-15℃。裝置儀器如圖Ⅶ-16，安瓿管放入冷凍槽中的干燥瓶內(nèi)。

抽氣一般若在30分鐘內(nèi)能達到93．3Pa（0．7mmHg）真空度時，則干燥物不致熔化，以后再繼續(xù)抽氣，幾小時內(nèi)，肉眼可觀察到被干燥物已趨干燥，一般抽到真空度26．7Pa（0．2mmHg），保持壓力6—8小時即可。

（6）封口抽真空干燥后，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管（圖Ⅶ-17）繼續(xù)抽氣，約10分鐘即可達到26．7Pa（0．2mmHg）。于真空狀態(tài)下，以煤氣噴燈的細火焰在安瓿管頸中央進行封口。封口以后，保存于冰箱或室溫暗處。

此法為菌種保藏方法中最有效的方法之一，對一般生活力強的微生物及其孢子以及無芽胞菌都適用，即使對一些很難保存的致病菌，如腦膜炎球菌與淋病球菌等亦能保存。適用于菌種長期保存，一般可保存數(shù)年至十余年，但設(shè)備和操作都比較復(fù)雜。