（1）預(yù)備安瓿管用于液氮保藏的安瓿管，食用菌滅菌鍋爐要求能耐受溫度突然改變而不致決裂，因而，需求選用硼硅酸鹽玻璃制造的安瓿管，安瓿管的巨細(xì)一般運(yùn)用75×10mm的，或能容1．2mm液體的。

（2）加保護(hù)劑與滅菌保存細(xì)菌、酵母菌或霉菌孢子等簡(jiǎn)略分散的細(xì)胞時(shí)，則將空安瓿管塞上棉塞，1．05kg/cm2，121．3℃滅菌15分鐘：若作保存霉菌菌絲體用則需在安瓿管內(nèi)預(yù)先參加保護(hù)劑如10％的甘油蒸餾水溶液或10％二甲亞砜蒸餾水溶液，參加量以能浸沒今后參加的菌落圓塊為限，然后再用1．05kg/cm2>，121．3℃滅菌15分鐘。

（3）接入菌種將菌種用10％的甘油蒸餾水溶液制成菌懸液，裝入已滅菌的安瓿管；霉菌菌絲體則可用滅菌打孔器，從平板內(nèi)切取菌落圓塊，放入含有保護(hù)劑的安瓿管內(nèi)，然后用火焰熔封。浸入水中查看有無縫隙。

（4）凍住再將已封口的安瓿管以每分鐘下降1℃的慢速凍住至-30℃。若細(xì)胞急劇冷凍，則在細(xì)胞內(nèi)會(huì)構(gòu)成冰的結(jié)晶，因而下降存活率。

（5）保藏經(jīng)凍住至-30℃的安瓿管當(dāng)即放入液氮冷凍保藏器（圖Ⅶ-14）的小圓筒內(nèi)，然后再將小圓筒放入液氮保藏器內(nèi)。液氮保藏器內(nèi)的氣相為-150℃，液態(tài)氮內(nèi)為-196℃。

（6）恢復(fù)培育保藏的菌種需求用時(shí)，將安瓿管取出，當(dāng)即放入38—40℃的水浴中進(jìn)行急劇凍住，直到悉數(shù)消融停止。再打開安瓿管，將內(nèi)容物移入適合的培育基上培育。

此法除適合于一般微生物的保藏外，對(duì)一些用冷凍枯燥法都難以保存的微生物如支原體、衣原體、氫細(xì)菌、難以構(gòu)成孢子的霉菌、噬菌體及動(dòng)物細(xì)胞均可長(zhǎng)時(shí)刻保藏，并且性狀不變異。缺陷是需求特別設(shè)備。

冷凍枯燥保藏法

（1）預(yù)備安瓿管用于冷凍枯燥菌種保藏的安瓿管宜選用中性玻璃制造，形狀可用長(zhǎng)頸球形底的，亦稱淚滴型安瓿管（圖Ⅶ-15），巨細(xì)要求外徑6—7．5mm，長(zhǎng)105mm，球部直徑9—11mm，壁厚0．6—1．2mm。也可用沒有球部的管狀安瓿管。塞好棉塞，1．05kg/cm2>，121．3℃滅菌30分鐘，備用。

（2）預(yù)備菌種，用冷凍枯燥法保藏的菌種，其保藏期可達(dá)數(shù)年至十?dāng)?shù)年，為了在許多年后不出過失，故所用菌種要特別留意其純度，即不能有雜菌污染，然后在最適培育基中用最適溫度培育，使培育出杰出的培育物。細(xì)菌和酵母的菌齡要求超越對(duì)數(shù)成長(zhǎng)時(shí)刻，若用對(duì)數(shù)成長(zhǎng)時(shí)刻的菌種進(jìn)行保藏，其存活率反而下降。一般，細(xì)菌要求24—48小時(shí)的培育物；酵母需培育3天；構(gòu)成孢子的微生物則宜保存孢子；放線菌與絲狀真菌則培育7—10天。

（3）制備菌懸液與分裝以細(xì)菌斜面為例，用脫脂牛乳2ml左右參加斜面試管中，制成濃菌液，每支安瓿管分裝0．2ml。

（4）冷凍冷凍枯燥器有成套的設(shè)備出售，價(jià)值貴重，此處介紹的是簡(jiǎn)易辦法與設(shè)備，可到達(dá)相同的意圖。

將分裝好的安瓿管放低溫冰箱中冷凍，無低溫冰箱可用冷凍劑如干冰（固體CO2>）酒精液或干冰丙酮液，溫度可達(dá)-70℃。將安瓿管插入冷凍劑，只需冷凍4—5分鐘，即可使懸液結(jié)冰。

（5）真空枯燥為在真空枯燥時(shí)使樣品堅(jiān)持凍住狀態(tài)，需預(yù)備冷凍槽，槽內(nèi)放碎冰塊與食鹽，混合均勻，可冷至-15℃。設(shè)備儀器如圖Ⅶ-16，安瓿管放入冷凍槽中的枯燥瓶?jī)?nèi)。

抽氣一般若在30分鐘內(nèi)能到達(dá)93．3Pa（0．7mmHg）真空度時(shí)，則枯燥物不致熔化，今后再繼續(xù)抽氣，幾小時(shí)內(nèi)，肉眼可調(diào)查到被枯燥物已趨枯燥，一般抽到真空度26．7Pa（0．2mmHg），堅(jiān)持壓力6—8小時(shí)即可。

（6）封口抽真空枯燥后，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管（圖Ⅶ-17）繼續(xù)抽氣，約10分鐘即可到達(dá)26．7Pa（0．2mmHg）。于真空狀態(tài)下，以煤氣噴燈的細(xì)火焰在安瓿管頸中心進(jìn)行封口。封口今后，保存于冰箱或室溫暗處。

此法為菌種保藏辦法中最有用的辦法之一，對(duì)一般生生機(jī)強(qiáng)的微生物及其孢子以及無芽胞菌都適用，即便對(duì)一些很難保存的致病菌，如腦膜炎球菌與淋病球菌等亦能保存。適用于菌種長(zhǎng)時(shí)刻保存，一般可保存數(shù)年至十余年，但設(shè)備和操作都比較復(fù)雜。